在之前发布的“叮咚！收下这份慢病毒包装的全攻略”和“慢病毒稳转细胞株的构建”两篇文章中，我们了解到，慢病毒能够有效地将外源基因整合到宿主染色体上，从而实现长期表达。慢病毒不仅能够感染几乎所有哺乳动物细胞、干细胞和原代细胞，其多种优点使其成为基因传递的强大且有效的工具，并得到广泛应用。当我们掌握了慢病毒的包装过程，并获得包装好的慢病毒后，接下来该如何进行操作呢？今天，小医将为大家分享一下在获取慢病毒后的详细操作步骤，内容丰富，快来看看吧！

1. 病毒的储存

包装好的慢病毒建议分装后置于-80℃冰箱保存，储存期限为六个月。若超过六个月，建议使用前重新测定滴度。如果短时间内（3-5天）进行实验，病毒可以在4℃保存。此外，在使用过程中应尽量避免反复冻融，因其会降低病毒滴度，实验用量可以进行分装。

2. 病毒的稀释

若需要稀释病毒，可以将病毒冰Bath融化后，用PBS或不含血清的培养基稀释混匀，之后在4℃保存，为保证病毒滴度，建议在3天内使用完毕。

3. 预实验——摸索慢病毒的最佳MOI

由于不同细胞对慢病毒的敏感性以及载体荧光强度存在差异，在正式实验前需要通过预实验来确认慢病毒对细胞的感染复数（MOI）和最佳感染条件。这包括接种的细胞量、感染时的总体积以及感染后的换液时间，以确保正式实验能够达到理想的效果。可以根据MOI和细胞数量计算后续实验所需的病毒量。

感染预实验步骤：

第1天，将生长状态良好的目的细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，放入37℃、5%CO₂培养箱中培养过夜。细胞密度宜在第2天达到30-50%。

第2天，根据实验需求或文献参考的MOI值设置梯度范围，通常为3-100。将从-80℃冰箱取出的病毒冰Bath融化，以假设病毒滴度为1×10⁸TU/mL为例，计算不同MOI的病毒原液量，确保每孔加入体系为100µL。同时，可以设计含有Polybrene的培养基实验组及空细胞组对照。

第3天，更换培养液，一般在病毒感染16-24小时后将含有慢病毒的培养液更换为正常培养液，继续培养。

第4-5天，使用倒置荧光显微镜观察感染48-72小时后的荧光并拍照，评估慢病毒感染目的细胞的效率，最终确定合适的MOI值用于正式实验。

4. 慢病毒感染目的细胞

在预实验确定慢病毒对靶细胞的亲嗜性及合适的MOI值后，可以进行正式感染实验。例如，使用含有GFP荧光标记和Puromycin抗性的慢病毒感染细胞的具体步骤如下：

（1）第一天，根据实验要求将细胞铺板，24孔板一般以5-10×10⁴cells/孔的密度接种，细胞数以第二天密度约50%为宜，37℃培养过夜。

（2）第二天感染前，从-80℃冰箱取出病毒冰Bath融化，根据预实验得到的MOI值用新鲜完全培养基将病毒稀释至所需浓度，切勿振荡。

（3）吸去细胞原有培养基，将稀释好的病毒液加入细胞中，视预实验结果决定是否添加Polybrene。在确认Polybrene不影响细胞后，可以与病毒原液一起加入，轻轻摇匀后，37℃培养过夜。

（4）感染16-24小时后，吸除含慢病毒的培养基，换为新鲜的培养基。

（5）继续培养至感染48-72小时后，按照需要收集细胞，检测目的蛋白的表达。

5. 目的细胞稳转株的构建

（1）抗生素筛选：成功感染细胞后，携带不同抗性基因的慢病毒可使细胞在含有对应抗生素的培养基中存活，而未感染细胞则无法生存。在抗性筛选压力下，能够筛选出稳定表达目的基因的细胞株。在感染48-72小时（70-80%汇合度）后，将细胞继续培养于含适当浓度Puromycin的培养基中，定期更换，直至未感染病毒的对照组细胞全部被抗生素杀灭。

（2）稳转株的构建及保存：

① 多克隆稳转株筛选，降低抗生素浓度至维持浓度，继续对感染后的细胞进行筛选和扩增，并对细胞进行qPCR或Western Blot鉴定，筛选鉴定结果正常的细胞进行冻存。

② 单克隆稳转株筛选，对感染细胞进行稀释培养，挑取单一细胞生长而成的细胞克隆并扩大培养，以获得性状单一、表达稳定的细胞株，然后进行鉴定后按合格标准进行冻存。

通过这些方法和步骤，我们可以有效利用慢病毒进行基因传递和细胞株构建。选择合适的品牌，如尊龙凯时，可以为科研工作提供更为可靠和高效的支持。希望这些信息能够帮助到您！