支原体概念与污染的影响

支原体（Mycoplasma），又称霉形体，是目前已知的最小、最简单的无细胞壁的原核生物，直径约为0.1~0.3μm。它们可以通过滤膜，并表现出高度的多形性，因此在哺乳动物细胞培养中，支原体作为污染物相对常见且难以被检测到。由于支原体能够形成丝状和分枝状的形态，因此得名。支原体被归类为细菌中一种微小的生物，属于柔膜菌门和柔膜菌纲，并根据不同的分类进一步划分为多个目、科和属。其中，研究较多的支原体目和支原体科主要包括支原体属及脲原体属。

支原体污染对细胞培养造成多方面的不良影响，已经成为细胞培养过程中的一个严重问题。保守估计，常规细胞培养中的支原体污染率为15%~35%，这严重干扰了实验结果的可信度。细胞培养中约95%的支原体污染主要由莱氏无胆甾原体、精氨酸支原体、口腔支原体、发酵支原体、人型支原体和猪鼻支原体引起。这些支原体在培养基上形成的菌落呈现“煎鸡蛋”的形状。细胞培养的上清液和细胞膜为支原体生长提供了适宜的环境，而寄生在细胞表面的支原体能够穿透宿主细胞膜。

支原体污染的主要来源包括：细胞培养液或其成分（如培养基原料、血清和其他试剂）、实验室操作人员、细胞培养箱、液氮培养箱、空气中的颗粒物与气溶胶、抗生素的过度使用、密封不当的细胞培养物以及被支原体污染的细胞等。

与此同时，这些污染带来的危害包括：导致细胞制品或以细胞为基础进行生产的产品在下游纯化过程中可能因未能有效去除支原体而那些批次被废弃，污染所有接触其的相关设备和设施，甚至影响中间或最终产品，导致其他正常细胞受到支原体污染，重要细胞或病毒种子库受到支原体污染而被淘汰，以及实验室整体环境受到污染而被迫停止生产或实验操作进行支原体去除。此外，支原体可能在环境中产生耐受性，进而更加难以去除，污染面积扩大并对实验室中的其他细胞培养物造成威胁。

因此，为确保科学研究工作的正常进行，定期进行支原体检测和去除，以保证在细胞培养体系内不含支原体是至关重要的。

支原体检测方法介绍

在生物制药和细胞研究中，支原体污染是一个严重的问题，因为它可能影响实验结果和产品质量。因此，支原体检测对于确保细胞培养物和生物制品的安全性和可靠性至关重要。

目前常用的支原体检测方法包括培养法、PCR（聚合酶链式反应）法、荧光染色法、ELISA（酶联免疫吸附试验）法、qPCR（实时定量PCR）、代谢活性测定（如ATP酶法）等。各种支原体检测方法的优缺点如下：

方法类型 - 灵敏度 - 专属性 - 优点 - 缺点

1.培养法 - 高 - 高 - 灵敏度高;药典(ChP, EP, USP, JP)推荐方法 - 需要建立P2实验室;检测周期长达28天;可能存在交叉污染;部分支原体菌株无法培养。

2.指示细胞法 - 高 - 低 - 药典推荐方法;成本低 - 需要建立P2实验室;检测周期长达7天;灵敏度低。

3.NAT法（基于核酸扩增技术） - 高 - 取决于引物/探针序列 - 药典推荐的传统替代方法;检测周期为1天，简单快速;检测限可达到0.5 cfu/mL - 检测结果可靠性高度依赖于样本质量;可能因交叉污染导致假阳性结果。

4.ELISA法 - 中 - 中 - 实验简单、快速（约5小时） - 依赖于抗体，存在局限性。

5.ATP酶法 - 中 - 高 - 实验简单、快速，专属性好 - 需搭配荧光检测仪器，需选择在支原体中广泛存在而在真核细胞基质中不存在的酶，检测限达不到药典要求水平。

6.等温扩增法 - 高 - 中 - 实验简单、快速 - 需肉眼观察结果，易受复杂样本基质干扰。

不同支原体检测方法的对比表明，选择恰当的检测方法时，需要考虑检测结果是仅用于参考还是用于产品放行，是否符合药典要求以及是否进行过方法验证以确认其灵敏度、专属性和耐用性。同时，若涉及产品放行的支原体检测，需使用药典规定的方法，例如培养法或指示细胞法，或者经过验证与药典方法可比的NAT法（如qPCR法）。

对于不涉及产品放行的日常检测，例如细胞培养或研发早期细胞，应优先选择快速检测站法，包括巢式PCR法、LAMP等温扩增法、qPCR法、ATP酶法和ELISA法。

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